Открытие свободных аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге

При гидролизе белков мяса, крови или других белковых отходов происходит не только расщепление пептидной связи, но и реакции вторичного порядка, в результате которых разрушаются отдельные аминокислоты.
Чтобы оценить качество получаемого гидролизата, требуется установить присутствие в нем той или иной аминокислоты. Особенно большой интерес представляет обнаружение незаменимых аминокислот.
Хроматографический адсорбционный анализ М. С. Цвета послужил основанием для разработки метода распределительной хроматографии ка бумаге. Этим методом можно не только обнаруживать отдельные аминокислоты и разделять их смесь, но и анализировать другие соединения — сахара, стероиды, красители и т. п.
Принцип метода распределительной хроматографии заключается в том, что подвижный растворитель, смачивая с одного конца -полоску фильтровальной бумаги, поднимается и увлекает за собой аминокислоты, которые были нанесены на бумагу.
Неподвижной жидкой фазой является вода воздушно-сухой фильтровальной бумаги, на которую наносят каплю раствора аминокислот, подвижной — растворитель — насыщенный раствор фенола или смесь нормального бутилового спирта и уксусной кислоты Аминокислоты движутся с разной скоростью вследствие того, что неодинаково растворяются в воде и растворителе. Чем выше растворимость аминокислоты в воде, тем меньше она продвинется в направлении движения растворителя. Наоборот, чем больше растворяется аминокислота в растворителе, тем дальше она поднимается от места нанесения.
После продвижения растворителя по длине полосы до конца бумагу высушивают и смачивают раствором реактива, который с аминокислотами дает цветную реакцию (например, нингидрин). На бумаге появляются цветные пятна, соответствующие отдельным аминокислотам. Положение пятна, т. е. отношение расстояния его середины от места нанесения испытуемой смеси к расстоянию фронта растворителя от места нанесения смеси, характерно для каждой аминокислоты. Эта величина называется коэффициентом распределения. Коэффициент распределения характерен для определенной аминокислоты только в определенных условиях (температуры, сорта бумаги, применяемого растворителя). Например, коэффициент распределения лейцина равен (рис. 49).

Для обнаружения аминокислот в исследуемом растворе методом распределительной хроматографии берут полоску фильтровальной бумаги (шириной 2—2,5 см, длиной 20—25 см). На одном конце, на расстоянии 5—7 см от края, делают простым карандашом кружок диаметром около 5 мм, на который наносят капилляром маленькую каплю раствора аминокислот и подсушивают ее на воздухе. Полоску бумаги двумя кнопками прикалывают к пробке, которой затем закрывают цилиндр. В цилиндр наливают насыщенного водой фенола столько, чтобы конец бумаги, на который нанесена капля, был погружен в жидкость на 1—2 см; пробку плотно закрывают.
Полоска бумаги должна висеть вертикально, не касаясь стенок цилиндра (рис. 50). Цилиндр помещают з термостат при 35—40°.

Бумага постепенно смачивается фенолом; когда фронт жидкости пройдет расстояние 10—12 см, бумагу вынимают и высушивают в сушильном шкафу при 100°.
Сухую бумагу опрыскивают раствором нингидрина и вновь подсушивают в сушильном шкафу в течение 5—6 мин., на бумаге появляются синие пятна. Измеряют расстояния от места нанесения испытуемого раствора до фронта растворителя и до середины пятен. Вычисляют коэффициенты для аминокислот (первое пятно — глутаминовая кислота, второе — лейцин или аланин).
Необходимые реактивы. Растворитель — насыщенный водой фенол — приготовляют смешиванием 50 г фенола с водой в делительной воронке; после отстаивания нижний слой сливают и используют в качестве растворителя.
Проявитель — 0,1%-ный раствор нингидрина в n-бутиловом или этиловом спирте.
Растворы аминокислот. В 10 мл воды растворяют: 1) 60 мг глутаминовой кислоты + 40 мг аланина; 2) 60 мг аспарагиновой кислоты +40 мг лейцина; 3) 60 мг глутаминовой кислоты + 40 мг глицина.
Исследуют один из трех указанных растворов аминокислот.