Все предложенные методы основываются на измерении степени перевода в раствор нерастворимого субстрата — эластина. Это определяют либо путем сравнения субстрата до воздействия ферментом и после него и нефелометрическими измерениями, либо но возрастанию содержания белка и продуктов его гидролиза в растворе. Последнее обнаруживают по увеличению оптической плотности при 280 ммк, по реакции с реактивом Фолина, с биуретовым реактивом или по изменению индекса рефракции. Часть методов основана на способности эластина присоединять молекулы некоторых красок, которые переходят в раствор при ферментативном растворении эластина. В качестве таких окрашенных субстратов можно использовать орцеин-эластин, азоэластин, нильблаусульфат-эластин и конго-рот-эластин.
Последние методы так же, как и вышеописанные, дают в стандартных условиях воспроизводимые результаты и имеют ряд преимуществ благодаря их наглядности, быстроте и небольшой трудоемкости.
Предварительно проведенные нами опыты с окраской эластина нильской голубой краской показали, что этот метод имеет ряд недостатков: краска недостаточно прочно связывалась с субстратом; освободившаяся в результате воздействия фермента на окрашенный эластин краска ингибирует дальнейшее действие фермента; наконец, процесс приготовления окрашенного субстрата очень длителен и трудоемок. Для определения эластазной активности нами принято указание М. Наутона и других о способности эластина окрашиваться конго-рот. Сущность предложенного метода заключается в том, что под действием фермента происходит освобождение краски из окрашенного эластина, по количеству которой в супернатанте и судят об активности фермента.
Известно, что на эластолитические свойства многих ферментов может оказывать ингибирующее влияние присутствие солей в реакционной смеси. Поэтому при определении эластазной активности необходимо принимать в расчет содержание солей в препарате, характер буфера и его концентрацию.
Так, при определении эластазной активности препаратов ферментов, полученных из культуры Вас. Subtilis, лучшие результаты оказались при использовании фосфатных и глициновых буферных растворов низкой концентрации.
В предлагаемой нами методике ферментная реакция прекращается, когда пробы помещают в ледяную баню и добавляют такой раствор ингибитора: хлористый натрий для поджелудочной эластазы, хлористый кальций для протеазы Вас. Subtilis.
Необходимые реактивы:
1. Буферные растворы (карбонатный pH 8,8, 0,01 М: фосфатный pH 9,8, 0,01М; глициновый pH 9,8, 0,01M);
2. 0,02%-ный раствор конго-рот в одном из указанных 'буферных растворов;
3. Раствор ингибитора;
4. Субстрат эластин, приготовленный из выйной связки крупного рогатого скота по Партриджу.
Для выделения эластина по Партриджу и другим свежую выйную связку крупного рогатого скота тщательно очищали от жира и пленок. Измельчали на мясорубке и экстрагировали 1%-ным раствором хлористого натрия (1:20) до отрицательной реакции на белок по пробе с трихлоруксусной кислотой. Затем осадок промывали дистилированной водой до отрицательной реакции на ион хлора. Далее массу многократно автоклавировали с водой (1 атм, 45 мин) до отрицательной реакции с биуретовым реактивом. После этого эластин промывали горячей дистиллированной водой, спиртом, окончательно высушивали сначала спирто-эфирной смесью, затем эфиром. Сухой порошок измельчали на кофейной мельнице и просеивали через капроновое сито.
Для определения активности к 20 мг эластина добавляли 2 мл раствора конго-рот. Перемешивали в течение 10—20 мин, пока краска полностью не адсорбировалось эластином. Затем добавляли 5 мл раствора испытуемого фермента, перемешивали и смесь инкубировали в течение 1 ч при 37° С. По окончании инкубации пробы немедленно переносили в ледяную баню, после чего вносили 0,5 мл раствора ингибитора. Осадок отделяли центрифугированием и в супернатанте фотометрированием с зеленым светофильтром определяли концентрацию конго-рот. Калибровочную кривую строили по растворам конго-рот. Активность выражали в процентах освободившейся краски (от ее количества, связанного белком) либо в миллиграммах растворенного эластина.
Для интенсивно окрашенных ферментных препаратов измеряли активность, определяя прирост азота в супернатанте.

---

• Определение общей протеолитической активности ферментов
• Определение общего количества летучих редуцирующих веществ в мясе
• Изучение распределения в мясе пуринового азота по фракциям
• Метод исследования основного вещества внутримышечной соединительной ткани
• Определение развариваемости коллагена
• Методы исследования фибриллярных компонентов внутримышечной соединительной ткани
• Фракционирование как способ оценки лабильности соединительной ткани мяса
• Количественное определение N-концевых групп в белках фракции миозина
• Определение легкогидролизуемого фосфора АТФ методом ее осаждения солями ртути
• Определение активности актомиозина по Баленовичу и Штраубу
• Определение содержания азота белков, экстрагируемых солевым раствором
• Определение растворимости белков фракции миозина
• Определение перевариваемости in vitro белков мяса ферментами при последовательном воздействии пепсина и панкреатина
• Количественное определение свободных аминокислот мясного экстракта при помощи хроматографии на бумаге
• Определение количества трудноизвлекаемого («связанного») гликогена
• Определение общего количества гликогена по Пфлюгеру в модификации Вильштеттера
• Трилонометрический метод определения содержания в мясе кальция
• Определение содержания в мясе свободной и связанной воды по методу Грау и Гамма
• Сравнительная характеристика объективных методов определения жесткости мяса
• Интенсификация процесса улучшения консистенции при созревании быстроохлажденного говяжьего мяса путем его обработки препаратом протеолитического фермента фицина
• Технология применения протеолитических ферментов для размягчения мяса при производстве натуральных полуфабрикатов
• Фицин, его свойства и методы получения
• Изменения компонентов внутримышечной соединительной ткани
• Изменения мышечных белков
• Изменения нежности и гидратации мяса
• Изменения микроскопической картины строения тканей мяса
• Общие сведения о применении протеолитических ферментов для улучшения качества мяса
• Механизм протеолиза для улучшения консистенции мяса
• Обработка ультразвуком для повышения нежности мяса
• Ускорение расслабления окоченения путем введения минеральных добавок