Методы исследования фибриллярных компонентов внутримышечной соединительной ткани

Как мы отмечали ранее, методы отделения коллагена и эластина от других составных частей мышц и органов животных с целью определения их содержания дают неудовлетворительные результаты, так как весьма громоздки и трудоемки. Они основаны либо на нерастворимости коллагена и эластина в обычных растворителях для белков, либо на избирательном растворении коллагена, когда другие компоненты остаются в осадке, или на устойчивости коллагена и эластина к действию протеолитических ферментов, переваривающих другие тканевые белки. Определяли коллаген и эластин после перевода коллагена в растворимый глютин автоклавированием с водой по разнице в весе остатков либо по азоту отдельных фракций.
Применявшийся многими исследователями гистологический метод позволяет прежде всего обнаружить присутствие тех или иных компонентов соединительной ткани, так как отдельные ее элементы могут окрашиваться в различный цвет.
Работы немецких исследователей направлены на то, чтобы гистохимический метод применить для количественной оценки содержания соединительной ткани в мясе и мясопродуктах, в частности в колбасах.
При этом для оценки колбасных изделий применяли метод окрашивания срезов по Хайденхану и определяли площадь поверхности, занятой частицами соединительной ткани, а полученные данные с помощью специальных интеграционных таблиц пересчитывали на объем колбас. Таким образом, содержание соединительной ткани выражали объемной величиной.
Этот метод не находит широкого распространения в настоящее время вследствие небольшой точности, и зависимости полученных результатов от многих факторов.
Выполненное Левеном и Гроссом сравнение методов анализа тканевого коллаген показало, что лучшие результаты дает метод гидролиза ткани с последующим определением специфических продуктов.
В 1950 г. Ньюменом и Логаном был разработан метод непосредственного определения соединительной ткани в биологических объектах, основанный на определении оксипролина, содержащегося в белках коллагеновой группы в уникально высоких и постоянных количествах. Начиная с этого времени, биохимики получили возможность довольно точно установить содержание коллагена и эластина в различных органах и тканях.
Метод определения оксипролина по Ньюмену и Логану заключается в его окислении до пиррола перекисью водорода в щелочных растворах в присутствии меди, удалении избытка перекиси и развитии окраски с пара-диметиламинобензальдегидом в кислой среде. Оксипролин, содержащийся в биологических материалах, освобождается гидролизом в присутствии соляной кислоты. Как было установлено, определению оксипролина может препятствовать присутствие триптофена и тирозина, которые с пара-диметиламинобеизальдегидом в аналогичных условиях также дают окрашенные в красный цвет соединения. Однако окраска их составляет всего лишь 0,7 и 1,5% (соответственно) от окраски, развиваемой теми же количествами оксипролина. Кроме того, при гидролизе белков в присутствии соляной кислоты триптофан разрушается. Авторы утверждают, что этот метод пригоден для определения в гидролизатах, содержащих от 40 до 100 мкг коллагена при воспроизводимости и точности определения ±2%:.
Метод Ньюмена и Логана подвергался многократной проверке и модификации. Большой вклад в изучение оптимальных условий определения был сделан Бейкером, Лэмпитом и Брауном, Мартином и Аксельродом, Вербицким и Детерейджем, Мияда и Таппелем, Личем.
Особенно важна работа Вербицкого и Детерейджа, которые подробно исследовали условия кислотного и щелочного гидролиза мышечной ткани, предшествующие определению в ней содержания оксипролина и самой реакции открытия оксипролина.
Для установления оксипролина, кроме метода Ньюмена и Логана, предложены и другие методы: полярографический Хвалила и Заградника, Тролла, основанный на реакции с нингидрином, Штегеманна с применением при окислении хлорамина-Т, Кивирикко и Лизмаа при использовании в качестве окисляющего агента гинобромита натрия. Последний является очень чувствительным и позволяет определять оксипролин в концентрации 1—5 мкг/мл. Однако наиболее широкое применение имеет метод Ньюмена и Логана, который апробирован и в России при определении качества мяса.
Таким образом, метод определения коллагена как компонента соединительной ткани по оксипролину — признанный. Что касается эластина, то ввиду малого содержания в нем оксипролина (около 2%) при его определении по этому показателю может возникнуть значительная ошибка. Поэтому этот компонент чаще определяют гравиметрически, т. е. взвешиванием остатка после, удаления из него всех более лабильных, чем эластин компонентов.
Для пересчета оксипролина в «соединительную ткань» необходимо знать или заранее определить соотношение коллагена и эластина в этой ткани. Так, для длиннейшей мышцы спины крупного рогатого скота Вербицкий и Детерейдж вывели соотношение коллагена и эластина как 84:16 и для перевода найденного количества оксипролина в соединительную ткань применили пересчетный коэффициент 8,07. Однако, принимая содержание оксипролина как индекс соединительной ткани в мясе, нет необходимости делать такой пересчет, если это не вызвано какими-либо особыми соображениями, тем более что в одном и том же мускуле могут иметь место изменения в соотношении коллагена и эластина у животных различного пола, возраста и в зависимости от условий содержания.
При определении содержания оксипролина в мясе мы брали навеску измельченного мяса 5 г. Если оно велось в одном из экстрактов, полученных при фракционировании внутримышечной соединительной ткани, то исходным материалом служили аликвотные порции по 10—20 мл экстракта. Нерастворившийся при автоклавировании остаток (IV фракция) полностью подвергали гидролизу.
К материалу в гидролизной колбе добавлялись: двадцатикратное (по отношению к весу белка в навеске) количество соляной кислоты с таким расчетом, чтобы получить 6 н. концентрацию ее в гидролизной колбе, и навеску хлористого олова. Последнюю брали в количестве 3/4 к весу белка для предупреждения образования гуминовых веществ, являющихся помехой. Гидролиз при легком кипении содержимого продолжался 7 ч.
По окончании гидролиза гидролизаты вначале нейтрализовали 6 н. раствором NaOH до момента появления устойчивой мути, а затем pH доводился до 8,0 насыщенным раствором углекислого натрия. Нейтрализованные гидролизаты переносили в мерную колбу и после охлаждения объем их доводили до 100 мл (при необходимости делали дополнительное разведение). Образовавшийся при нейтрализации осадок Sn(OH)2 удаляли фильтрацией через плотный бумажный фильтр. Гидролизаты были прозрачными, золотисто-желтого цвета.
Для определения в полученных гидролизатах оксипролина по Ньюмену и Логану употреблялись следующие реактивы:
1. NaOH — 2,5 н. раствор; 2. CuSO4 — 0,05М раствор; 3. H2O2 — 6%-ный раствор; 4. H2SO4 ~ 3 н. раствор: 5. Парадиметиламинобензальдегид (перекристаллизованный из этилового спирта) —5%-ный раствор в нормальном пропиловом спирте.
Исследования велись в химических пробирках нейтрального стекла.
В каждую пробирку вносили 1 мл испытуемого раствора, 2 мл свежеприготовленной смеси равных объемов растворов 0,05М CuSO4 и 2,5 н. NaOH и прибавляли 1 мл 6%-ного раствора перекиси водорода. После внесения перекиси водорода содержимое пробирок сразу же перемешивали, осторожно встряхивая, и отмечали время, отведенное на окисление оксипролина. Через 5 мин, в течение которых встряхивали содержимое пробирок несколько раз, пробирки помещали в водяную баню с температурой 75° С на 10 мин для удаления избытка перекиси водорода. Присутствие последней в дальнейшем может мешать развитию окрашивания. Для полного удаления перекиси пробирки несколько раз встряхивали. После се удаления их охлаждали проточной водопроводной водой, и в каждую добавляли по 4 мл 3 н. H2SO4 и по 2 мл раствора пара-диметиламинобензальдегида в Н-пропиловом спирте. Содержимое тщательно перемешивали.
Затем пробирки погружали в водяную баню с температурой 75° С на 20 мин, после чего быстро охлаждали. Интенсивную красную окраску, образующуюся при нагревании, измеряли фотоэлектроколориметром с зеленым светофильтром в кювете толщиной 1 см.
Параллельно проводили развитие окраски со стандартными растворами оксипролина, соответствующей (близкой к ожидаемой в опыте) концентрации. Это проводилось с целью контроля колебаний в результатах окрашивания растворов, содержащих одинаковое количество оксилролина.
Построение калибровочного графика по чистому оксипролину свидетельствует о том, что в пределах концентраций оксипролина от 5 до 25 мкг реакция подчиняется закону Ламберта—Бера.
Оптическая плотность окрашенных растворов измерялась против контрольных образцов, в которых испытуемые растворы заменяли дистиллированной водой.
Расчет содержания оксипролина в мясе производился по формуле
Cоп = ab/c * 100,

где Cоп — содержание оксипролина;
а — мг оксипролина в 1 мл испытуемого гидролизата;
b — объем испытуемого гидролизата с учетом разведения;
с — навеска ткани, взятая для гидролизата, г.
Результат выражался в мг% к сырой ткани.
Точность определения составляет ±2,0%.