Метод исследования основного вещества внутримышечной соединительной ткани

Долгое время оценивали соединительную ткань в различных органах и тканях почти исключительно по соотношению имеющихся в ней фибриллярных компонентов — коллагена и эластина. Однако за последние годы неуклонно возрастает внимание к ее третьему компоненту — основному (межуточному) веществу. Как для биологов и врачей, так и для исследователей в области мясной промышленности большой интерес представляет изучение соединительной ткани в ее морфологической целостности. Так, например, если для оценки качества жиловки мяса может быть достаточно определить наличие в нем фибриллярных соединительнотканых компонентов, то оценка зависимости консистенции мяса от количества содержащейся в нем соединительной ткани до последнего времени еще не была должным образом разработана. Количеством коллагена и эластина в мясе нельзя объяснить различную развариваемость соединительной ткани различных образцов мяса при их кулинарной обработке, так как этот показатель находится в зависимости не только от доли этих веществ в мясе, но и от состояния коллагеновой соединительной ткани.
Несомненно, что степень полимеризации межуточного вещества, прочность связи его с фибриллярными компонентами и комплексность с другими белками зависят от возраста животного и многих других факторов и имеют большое влияние на соединительную ткань мяса (ее лабильность и физико-химические свойства). Если рассматривать соединительную ткань как морфологическое целое из коллагеновых и эластиновых волокон, сцементированных основным веществом и как бы погруженных в него, то даже самые чувствительные методы определения фибриллярных компонентов не в состоянии будут достаточно полно объяснить причины ее изменений.
В исследованиях, проводимых для медицинских целей, почетное место занимает гистохимический метод оценки межуточного вещества. С целью выявления полисахаридов основного (межуточного) вещества чаще других Применяют реактив Шиффа (лейкофуксин). Дифференциальную оценку кислых мукополисахаридов, таких как гиалуроновая и хондроитинсерная кислоты, осуществляют метахроматическим окрашиванием их с помощью основных красителей тиазиновой группы (толуидин блау, тионин и др.).
Однако гистологическим методом можно выявить лишь наличие и направление изменений исследуемого компонента, а не вскрыть их биохимическую сущность.
Аналитически мукополисахариды в биологических объектах оценивают по их составным частям (аминосахара, гексуроновая кислота) либо путем препаративного выделения из исследуемой ткани. Преимущество последнего то, что этот способ дает возможность анализировать физические и химические свойства выделенных веществ, их состав и структуру.
При выделении мукополисахаридов неизбежны как потери веществ, так и изменения, вызываемые даже очень осторожной обработкой. Поэтому, несмотря на большое количество методов, предложенных для выделения мукополисахаридов, широкого распространения они не получили. При исследовании такого объекта, как мышечная ткань, выделить мукополисахариды еще труднее, так как их содержание очень невелико.
Удовлетворительный метод для определения гексозаминов как составной части мукополисахаридов в биологических объектах предложили в 1933 г. Эльсон и Морган. Основа его — конденсация гексозаминов с ацетилацетоном или этилацетатом с образованием производных пиррола и затем развитие красной окраски с пара-диметиламинобензальдегидом.
Методы, разработанные позже, представляют собой модификации метода Эльсона и Моргана и направлены на устранение помех и улучшение условий проведения реакций, связанных с образованием окраски.
При практическом применении метода Эльсона и Моргана было обнаружено, что гидролизаты, приготовленные из различных растительных и животных тканей, содержат большое количество веществ, проявляющих себя в данном случае как хромогены со спектром поглощения, близким производным гексозаминов.
Были предложены различные способы устранения влияния этих помех: обработка гидролизатов «основным реактивом», содержащим концентрированную трихлоруксусную кислоту, хлористый и едкий натр, отгонка летучих хромогенов, образующихся при реакции ацетилирования, хроматография на катионообменных смолах.
Бос подробно исследовал условия, необходимые для получения оптимальных результатов количественного определения гекеозаминов в тканях и органах животного. Его данные положены в основу исследований, проводившихся позже. Метод Боса был успешно применен в исследованиях Касавиной и Зенкевич.
При проведении гидролиза на кипящей водяной бане Бос определил потери гексозамина за 15 ч в зависимости от концентрации кислоты.

Сравнивая результаты гидролиза образцов плазмы, печени, желез, соединительной ткани, Бос установил также, что оптимальное время гидролиза зависит от вида гидролизуемой ткани.
По нашим данным, при гидролизе мяса на кипящей водяной бане в 4 н. растворе HCl получаются следующие результаты:

данных условиях гидролиза составляет 1 ч.
Гидролиз проводишь в стеклянных пробирках с пришлифованными пробками. Кислоту брали в 35-кратном количестве по отношению к количеству белка в навеске.
Для гидролиза использовали 2 г навески измельченного мяса или аликвотную порцию экстрактов фракций I, II, III — 10 мл.
По окончании гидролиза пробирки охлаждали, и гидролизаты подвергали очистке на катионообменниках.
По данным Боса, на колонку длиной 25 см и диаметром 1 см, содержащую 5 мл суспензии Дауэкс-50 в воде (1:1), единовременно можно дать в зависимости от концентрации соляной кислоты в испытуемом гидролизате 10 мл 0,25 н., 5 мл 0,5 н. или 2 мл 1 н. солянокислотного гидролизата.
Бос определил, что скелетная мышца крысы содержит меньше 28 мг % гексозаминов к весу сырой ткани. Наши предварительные опыты также показали небольшое содержание гексозаминов в мясе. Поэтому для приведения гидролизатов к желаемой кислотности (0,25 н. HCl) мы проводили их выпаривание в вакууме до сухого состояния с последующим разведением остатка в кислоте соответствующей крепости.
В катионообменник вносили 10 мл полученного таким образом раствора.
При прохождении гидролизатов через колонку гексозамины адсорбируются катионитом, а многие мешающие вещества проходят через нее и дополнительно вымываются водой. На колонке задерживаются гуминовые вещества, которые вымываются щелочью уже после элюирования гексозаминов.
После прохождения гидролизата колонку промывали 10 мл дистиллированной воды, а затем элюировали гексозамнны 7 мл 2 н. раствора HCl и элюат собирали в мерные цилиндры или колбы объемом 10 мл. По окончании сбора элюат нейтрализовали 2 и. NaOH до розового окрашивания по фенолфталеину, затем 1 н. HCl по каплям до исчезновения розовой окраски. При этом количество добавленной щелочи и кислоты учитывали для того, чтобы в дальнейшем можно было уравнять концентрацию соли, оказывающей влияние на ход определения. Нейтрализованный, совершенно бесцветный и прозрачный элюат доводили дистиллированной водой до объема 10 мл.
Для определения гексозаминов употребляли следующие реактивы:
1. Ацетилацетон, подвергнутый перегонке в вакууме, бесцветный 2%-ный раствор в 1 н. Na2CO3; 2. Пара-диметиламинобензальдегид, перекристаллизованный из этилового спирта, 2,7%-ный раствор в смеси этилового спирта и концентрированной HCl в отношении 1:1 (реактив Эрлиха); 3. NaCl — 4 н. раствор; 4. Na2CO3 — 1 н. раствор.
Использовали пробирки из нейтрального стекла с пришлифованными пробками.
В них наливали 1,5 мл испытуемого элюата. Параллельно с испытуемыми брали стандартные растворы глюкозамина в концентрациях, близких к ожидаемым в опытных растворах. В контрольные пробирки вместо испытуемого раствора брали дистиллированную воду. Во все пробирки приливали рассчитанный объем 4 н. раствора поваренной соли (так, чтобы после доведения объема до 3 мл получился 2 н. раствор) и дистиллированной воды — до объема 3 мл.
Затем во все пробирки вносили по 1 мл свежеприготовленного раствора ацетилацетона в 1 н. Na2COe и после перемешивания содержимого их плотно закрывали пробками и пометали в водяную баню, погружая в воду только до уровня содержимого.
Ацетилирование проводили при температуре 89—92° С в течение 45 мин. Более низкая температура, как указывает Бос, приводит к неполному ацетилированию; более высокая — снижает специфичность реакции.
По истечении 45 мин пробирки охлаждали в проточной водопроводной воде. В каждую приливали 3 мл этилового спирта, 1 мл реактива Эрлиха и еще 3 мл этилового спирта. Каждый раз перемешивали содержимое пробирок и. следующее добавление делали не раньше, чем через 5 мин после предыдущего.
После внесения реактива Эрлиха в течение 40—60 мин интенсивно выделяются пузырьки углекислого газа. Для ускорения выделения углекислого газа пропускали воздух через капиллярную трубку, погруженную в испытуемый раствор. Окраска развивается довольно быстро, и она очень устойчива. Колориметрировали по сравнению с контрольным на колориметре ФЭК-М с зеленым светофильтром в кювете толщиной 2 см.
Определения проводили при концентрации гексозаминов от 10 до 30 мкг в 1 мл.
Суммарное определение гексозаминов в мясе практически не дает точного представления об их содержании в соединительной ткани мяса, так как часть их связана с белками плазмы. Эта часть может быть удалена экстракцией 0,6 M раствором KCl.
Мак Интош установила, что остающиеся в строме гексозамины полностью принадлежат мукопротеинам соединительной ткани и могут служить индексом содержания этой большой и важной группы веществ соединительной ткани.
Вычисляя разницу между общим количеством гексозаминов мяса и их содержанием в фракции плазменных белков (в солерастворимой фракции), мы получили возможность не только оценить количество мукопротеинов внутримышечной соединительной ткани, но и убедиться в одновременном изменении лабильности этого компонента. Последняя определяется по его растворимости в щелочи (исследование «щелочерастворимой фракции»).
Точность в большинстве случаев составляет ±10,0% от найденной величины.