Количественное определение свободных аминокислот мясного экстракта при помощи хроматографии на бумаге

Для определения свободных аминокислот мяса были проверены два метода хроматографии на бумаге.
Первый метод — хроматография на бумаге при проявлений пятен аминокислот изатином по Бояркину.
Хроматограмму малого размера (16x25 см) лопатообразной формы предварительно обрабатывают 0,067 M фосфатно-цитратным буфером, имеющим pH 4,0—6,0. Затем в точку, находящуюся в середине узкой полосы бумаги по месту ее присоединения к основному листу, наносят пятно испытуемого раствора и аминокислоты разделяют по методу восходящей хроматографии. Для этого на дно камеры высотой 15—20 см ставят узкую кювету с растворителем, в который опускают узкий конец (фитиль) хроматограммы. Сверху хроматограммы закрепляют между стеклами, закрывающими камеру. Растворитель, поднимаясь по фитилю и широкой части хроматограммы, переходит в выступающий наружу конец хроматограммы, где испаряется, создавая тем самым постоянный восходящий поток, необходимый для разделения.
Для хроматографирования аминокислот применяют в качестве растворителя верхний слой следующих смесей:
А — бутиловый спирт — ледяная уксусная кислота — 4,5 M фосфатно-цитратный буфер, имеющий pH 4,0. Соотношение указанных компонентов смеси 4:1:5,
Б — бутиловый спирт — ледяная уксусная кислота — 4,5 М. фосфатно-цитратный буфер, имеющий pH 6,0 в отношениях 4:1:5.
В — бутиловый спирт — муравьиная кислота — 0,067 M фосфатно-цитратный буфер, имеющий pH 4,0 в отношениях 4:1:5.
По времени хроматографирования аминокислоты по этому методу разделяют на две группы: быстро- и медленнодвигающиеся; за границу этих двух групп принимают пролин и аланин. Для разделения медленнодвигающихся аминокислот требуется от 30 до 40 ч, а для быстродвигающихся — 7—10 ч. После просушивания хроматограммы пятна аминокислот проявляют изатином, Основной недостаток метода — пригодность только для качественного определения аминокислот.
Однако изатиновая реакция не только облегчает идентификацию аминокислот но и делает ее более достоверной, поскольку, кроме положения пятна, используют второй признак — пятна аминокислот, при этом принимают различную окраску от красной до синей с различными оттенками.
Учитывая особенности данного метода, целесообразно его рекомендовать в качестве вспомогательного и применять в отдельных случаях для идентификации, когда возникают сомнения в присутствии той или другой аминокислоты.
Второй из сравнивавшихся — метод количественного определения аминокислот при помощи хроматографии на бумаге — более удобный и дает достаточно хорошо воспроизводимые результаты. Метод основан на образовании медных производных аминокислот с нингидрином. Он был предложен Боде и Гири с последующими модификациями Зайцевой и Тюленевой, а также Пасхиной и применен для исследования мяса.
Для анализа необходимо предварительно извлечь из мяса содержащиеся в нем свободные аминокислоты. Это производится по методу Авапары этиловым спиртом. При этом 1 г мясного фарша тщательно растирают в ступке с 1,5—2,0 г стекла и переносят в центрифужную пробирку. Затем к смеси добавляют 10 мл 94%-ного этилового спирта и тщательно перемешивают стеклянной лопаточкой. Смесь центрифугируют в течение 15 мин при 2,5 тыс. об/мин. Спиртовой центрифугат сливают в фарфоровую чашку и в тот же центрифужный стакан добавляется еще 10 мл 94%-ного спирта. Смесь вновь перемешивают и центрифугируют еще 10 мин при 2,5 тыс. об/мин. Второй центрифугат сливают в ту же фарфоровую чашку и жидкость выпаривают досуха на водяной бане при 60° С. Затем в чашку добавляют 5 мл дистиллированной воды и сухой, слегка желтоватый остаток тщательно растворяется. Затем его переносят в пробирку, где обезжиривают испытуемый раствор эфиром. Для этого в пробирку с раствором аминокислот добавляют 3 мл эфира, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение 5—10 мин. После расслаивания водно-эфирной смеси эфир удаляют пастеровской пипеткой с водоструйным насосом. Обработку эфиром повторяют 2—3 раза. Затем водный раствор аминокислот упаривают досуха на водяной баке при 60° С. К полученному сухому остатку добавляют 0,5 мл дистиллированной воды или изопропилового спирта. Для получения точных и хорошо воспроизводимых результатов, мы пользовались хроматограммой особой формы, изображенной на рис. 77.

Ширина и длина перешейка могут быть изменены в зависимости от сорта бумаги. Для быстровпитывающей бумаги ширина перешейка должна быть меньше, чем для медленновпитывающей.
Раствор смеси свободных аминокислот в количестве 30 мкл наносили в точки 1, 2, 3, 4, 5.
Для разделения аминокислот с близкими значениями коэффициента распределения Rf двукратно пропускают растворитель бутанол — ледяная уксусная кислота — вода в соотношении 40:10:50, а затем снова 2 раза пропускают тот же растворитель, но в соотношении 40:15:5 (это соотношение рекомендовано Pao и Вадхвани).
Просушенные хроматограммы проявляют, проводя через 0,5%-ный раствор нингидрина в 95% ацетоне, содержащем 1% ледяной уксусной кислоты.
После испарения ацетона при комнатной температуре хроматограммы прогреваются в термостате три 60° С в течение 15 мин в темноте.
Для увеличения устойчивости окраски пятен аминокислот при хранении хроматограммы отрыскивают 1%-ным раствором азотнокислой меди в ацетоне с добавлением к 1 л такого раствора 0,5 мл концентрированной азотной кислоты (56%). При этом лиловая окраска аминокислот переходит в оранжево-красную, вследствие образования медного производного ДИДА (дикетогидриндилединдикетогидриндамин).
Хроматограммы высушивают на воздухе при комнатной температуре.
Оранжево-красные пятна аминокислот вырезают, разрезают на мелкие кусочки к помещают в пробирки. Пятна всех аминокислот, за исключением аспарагиновой кислоты и аланина, вырезают с 3 хроматограмм. Пятна аспарагиновой кислоты и аланина вырезают с одной хроматограммы. Каждое пятно заливают 10 мл 75%-ного этилового спирта. Пробирки закрывают пробками, и содержимое их тщательно перемешивают для полной экстракции из бумаги окрашенного продукта.
Экстракция продолжается 1,5—2 ч в темноте при комнатной температуре.
Одновременно с пятнами аминокислот вырезают из бумаги контрольные участки, равные по площади опытным, которые обрабатывают таким же образом.
Интенсивность окраски экстрактоз измеряют на спектрофотометре СФ-4 при длине волны 530 ммк в кюветах толщиной 1 см против контрольного экстракта из бумаги.
Расчет содержания свободных аминокислот мяса производится по коэффициенту R1 составленному для аминокислот — свидетелей по формуле

R = E/CD.

где E — оптическая плотность соответствует показателям спектрофотометра и равняется логарифму отношения интенсивности света, входящего в кювету, к интенсивности света, выходящего из кюветы;
С — концентрация раствора, выраженная в мкг;
D — толщина кюветы, см.
Изменение постоянства величины R при различных концентрациях аминокислот указывает на пределы концентрации, в которых возможно производить определение.
На основании известного для каждой аминокислоты коэффициента R рассчитывают концентрацию свободных аминокислот в спиртовой вытяжке из мяса по формуле

C = EP*100/DRab.

где С — содержание аминокислоты в мг на 100 г мяса;
E — оптическая плотность;
P — разведение при элюировании;
а — количество мл, нанесенное на хроматограмму;
b — навеска мяса, г;
100 — пересчет па 100 г мяса.