Фракционирование как способ оценки лабильности соединительной ткани мяса

Метод фракционирования применим для получения характеристики состояния компонентов внутримышечной соединительной ткани на различных этапах процесса естественного созревания и при обработке мяса протеолитическими ферментами. Это объясняется тем, что распределение коллагена в основного вещества по фракциям соответствует их состоянию, их лабильности по отношению к различным агентам.
Изучение лабильности этим методом представляется особенно целесообразным в отношении основного вещества, которое при существующих методах препаративной химии не может быть выделено из мяса без изменения исходного состояния.
Канвой для разработки метода фракционирования послужил описанный в работе Миллера и Касталека способ выделения стромы (соединительнотканой основы) мяса для изучения фибриллярных компонентов соединительной ткани.
Принятая нами методика фракционирования основана на том, что солевая экстракция животной ткани, проведенная в определенных условиях, дает возможность отделить компоненты соединительной ткани, входящие в ее состав, от большой группы белков (как было показано опытами — до 40%), не имеющих к ней отношения. Кроме того, она одновременно позволяет определить в остатке количество гексозаминов принадлежащих основному веществу внутримышечной соединительной ткани.
Дополнительная экстракция остатка щелочью приводила к отделению от стромы наиболее лабильной фракции коллагена (10—15% от его содержания в мясе), а также давала возможность проследить, как протекает растворение основного вещества, чувствительного к действию щелочи.
При дальнейшем автоклавировании нерастворившегося в щелочи остатка мы не старались достичь полного отделения коллагена, так как только таким путем возможно выявить лабильность главной его фракции.
Растворимая при автоклавировании фракция содержала 70—80 % коллагена и небольшое количество гексозаминсодержащих веществ, которые мы назвали «труднорастворимыми».
Остаток после автоклавирования состоял из эластина, не удаленного однократным автохлавированием коллагена, и содержал следы гексозаминов, указывающих на присутствие незначительных количеств мукополисахаридов.
Для изучения изменений внутримышечной соединительной ткани наиболее удобным объектом признана полусухожильная мышца, которая содержит сравнительно большие количества соединительнотканых белков и одновременно представляет собой одну из наиболее однородных мышц говяжьей туши.
Навеску измельченного мяса (20 г) заливали охлажденным 0,6М раствором KCl и тщательно размешивали в течение 10 мин. Для лучшего улавливания белков стромы в экстракционную смесь добавляли в небольшом количестве стеклянную вату. Экстракт отделяли центрифугированием, а остаток дважды промывали тем же раствором KCl.
Объединенный с промывными порциями экстракт представлял собой фракцию, которую назвали солерастворимой, и, как было установлено, она не содержала соединительнотканых компонентов.
Остаток после этой обработки заливали 150 мл 0,1 н. раствором NaOH и настаивали в течение 16—18 ч при комнатной температуре; его периодически перемешивали — 4—5 раз в течение всего времени настаивания. Щелочной экстракт также отделяли центрифугированием, остаток промывали двумя порциями того же раствора щелочи и жидкость после промывки присоединяли к основному экстракту, получая таким путем II (щелочерастворимую) фракцию.
Остаток после щелочной экстракции нейтрализовали до pH 7,0 и подвергали автоклавирозанию с 100 мл воды при давлении в автоклаве около 4,5 бар в течение 3 ч. По окончании автоклавирования фильтровали при температуре около 60° С с отделением нерастворившейся части на стеклянной вате; остаток, задержанный на фильтре из стеклянной ваты, промывали водой той же температуры.
Полученный при автоклавировании экстракт, объединенный с промывными водами, составлял III фракцию, названную фракцией, растворимой при автоклавировании.
Остаток после автоклавирования представлял собой IV, нерастворимую при автоклавировании фракцию.
Полученные фракционированием экстракты оценивали по содержанию в них оксипролина и гексозаминов, характеризующих соответственно количество фибриллярных соединительнотканых белков (коллагена и эластина) и аморфного основного вещества. Кроме того, оценку производили по содержанию общего количества азотистых веществ.
Ниже приводится схема фракционирования компонентов внутримышечной соединительной ткани мяса.