Протеазы растительного, животного или микробного происхождения не обладают строгой специфичностью, однако различные белки гидролизуются ими с неодинаковой скоростью. Поэтому при определении протеолитической активности фермента выбор субстрата должен учитывать целевое назначение данного препарата.
В литературе освещены многие методы определения протеолитической активности, которые различаются характером используемого субстрата, а также способом оценки воздействия фермента на него. В качестве субстратов употребляют казеин, гемоглобин, желатин, эдестин, фибрин, ацидальбумин и другие белки, а также синтетические пептиды.
Результаты переваривания белка под действием фермента чаще всего определяют по приросту в инкубационной смеси количества свободных аминных или карбоксильных групп (фор-мольное титрование, определение аминного азота по Ван-Слайку, окраска нингидрином и т. п.), по увеличению в безбелковой части инкубационной смеси пептидов (биуретовая реакция), по нарастанию в безбелковом фильтрате содержания некоторых аминокислот (тирозина, триптофана, аргинина). Последние обнаруживаются по цветным реакциям или по изменению поглощения в ультрафиолете.
Особое место занимают методы, основанные на использовании в качестве субстратов комплексов белков с красителями (азоказеин, нитроказеин, азофибрин и др.), а также на определении скорости свертывания молока и уменьшении вязкости желатина.
Приведенные в предыдущей главе данные свидетельствуют о том, что интенсивность воздействия препаратов протеолитических ферментов, определяемая по уменьшению жесткости мяса, непропорциональна их протеолитической активности, установленной по степени расщепления обычно применяемых субстратов.
Причиной этого несоответствия может быть: различная способность ферментов расщеплять белки соединительной ткани; различное их отношение к белку — субстрату, взятому для определения активности, и к белкам мышечной ткани; неодинаковый характер действия ферментов на белковый субстрат и зависящее от этого различие в образующихся продуктах протеолиза.
Для практического использования в мясной промышленности представляют интерес ферменты, которые воздействуют на структурные мышечные белки и компоненты внутримышечной соединительной ткани, вызывая в них изменения, характерные для начальной стадии протеолиза. Ферменты, которые переваривают саркоплазматические белки и не затрагивают при этом указанные выше белковые фракции, очевидно, не могут быть использованы в качестве размягчителей мяса.
Поэтому мы производим оценку общей протеолитической активности следующими методами.
Метод водно-спиртового титрования. Определение производят по прописи, рекомендуемой Институтом спиртовой и ферментной промышленности. Для этой цели приготовляют 5%-ный раствор желатина в фосфатном буфере, имеющем pH 7,3. К 10 мл раствора желатина добавляют 2 мл 0,1%-ного раствора фермента и полученную смесь помещают на 3 ч в термостат при 40° С. По истечении указанного срока 1 мл реакционной смеси отбирают в коническую колбочку емкостью 50—100 мл, туда же вносят 20 мл 95—96%-ного этанола и 0,2 мл 1%-ного спиртового раствора тимолфталеина. Пробу титруют 0,1 н. NaOH. Конец титрования устанавливают по методу Виноградовой: после появления голубой окраски прибавляют еще 4 капли щелочи и на этом титрование заканчивают.
В контрольном опыте 1 мл смеси отбирают немедленно после соединения растворов фермента и субстрата и вливают в 20 мл этанола. Суммарное количество азота аминокислот и полипептидов, образовавшихся при ферментативном гидролизе, рассчитывают по нижеприведенным формулам.

где ПА — протеолитическая активность в мг азота, образуемого 1 мл раствора фермента за 1 ч в единицах;
а — количество мл 0,1 н. NaOH, пошедшее на титрование опытной (термостатированной) пробы;
aк — то же для контрольной пробы;
К — коэффициент поправки 0,1 и. раствора щелочи;
12 — общий объем реакционной смеси, мл;
1,4 — количество азота, соответствующее 1 мл 0,1 н. раствора NaOH, мг;
3 — продолжительность протеолиза, ч;
2 — количество ферментного раствора, взятое в реакцию, мл.
Пересчет на активность 1 г препарата фермента производят исходя из разведения препарата

где ПА1 — протеолитическая активность в мг азота, образуемого 1 г сухого препарата за 1 ч;
1000 — пересчет на граммы;
100 — объем, в котором растворена навеска фермента, мл;
100 (в знаменателе) — навеска фермента, взятая для приготовления испытуемого ферментного раствора, мг.
Определение количества конечных и промежуточных продуктов распада миозина. Мы считали необходимым также оценивать протеиназную активность препаратов, предназначенных для размягчения мяса, по их действию на структурные белки мышечной ткани. В качестве субстрата был выбран белок миозина. Сущность предлагаемого метода сводится к следующему. В определенных условиях расщепляют миозин испытуемым препаратом фермента, затем в безбелковом трихлоруксусном фильтрате определяют суммарный прирост промежуточных и конечных продуктов расщепления белка по цветной реакции, разработанной Лоури.
Миозин готовили из парной длиннейшей мышцы спины крупного рогатого скота. Измельченную на холоде в мясорубке мышцу экстрагировали 0,6М раствором хлористого натрия (1:2 к весу измельченного мяса) в течение 15 мин. Центрифугировали с охлаждением. Для осаждения миозина к центрифугату добавляли равный объем ацетатного буфера pH 5,2 и разбавляли 10 объемами дистиллированной воды. Суспензию оставляли на ночь при температуре 4° С. Затем жидкость декантировали, осадок отделяли центрифугированием и промывали 4 раза холодной дистиллированной водой. Влажный осадок миозина растворяли в 0,6М растворе хлористого натрия, фильтровали и вновь осаждали миозин вышеуказанным методом. Осадок отделяли центрифугированием, промывали холодной водой. Выделенные белки фракции миозина сушили на холоде ацетоном или лиофилизиро-вали.
Необходимые реактивы:
1. Суспензия миозина (20 мг %) в 0,6 н. NaCl;
2. Фосфатный буфер 0,067 М, pH 7,3;
3. Трихлоруксусная кислота 0,3 М;
4. Едкий натр 0,6 М;
5. Реактивы для цветной реакции по Лоури:
а) 2%-ный раствор углекислого натрия в 0,1 н. едком натре;:
б) 0,5%-ный раствор сернокислой меди в 1%-ном виннокислом натрии или калии;
в) смесь 50 мл реактива «а» с 1 мл реактива «б»;
г) реактив Фолина.
Для его приготовления растворяли 100 г вольфрамовокислого натрия и 25 г молибденовокислого натрия в 700 мл дистиллированной воды в колбе на 1500 мл, прибавляли 50 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты и 100 мл концентрированной соляной кислоты. Смесь осторожно нагревали в течение 10 ч в колбе с лабораторным обратным холодильником. Затем зеленый раствор охлаждали, добавляли 150 г сернокислого лития, 50 мл воды и несколько капель брома. Смесь нагревали под тягой в колбе без холодильника до удаления избытка брома, охлаждали и доводили общий объем до 1000 мл (добавлением воды). Готовый реактив не должен иметь зеленый оттенок. Реактив надо сохранять защищенным от света и пыли.
Калибровочную кривую строили по стандартному раствору тирозина, содержание которого рассчитывали на основании данных определения в его препарате азота по Кьельдалю.
Количество конечных и промежуточных продуктов распада миозина определяли следующим путем. Отмеряли по 5 мл суспензии миозина в контрольные и опытные пробирки, затем их и раствор фермента в буфере прогревали отдельно на водной бане при 37° С в течение 3 мин. После этого в контрольные пробирки добавляли 10 мл раствора трихлоруксусной кислоты и во все пробирки приливали по 5 мл раствора фермента. Опытные пробы перемешивали и инкубировали в течение 20 мин при 37° С, после чего осаждали белки 10 мл раствора трихлоруксусной кислоты. Через 10 мин после осаждения белков пробы фильтровали. 2 мл безбелкового фильтрата нейтрализовали добавлением 0,5 мл 0,6 н. едкого натра, приливали по 5 мл реактива «в» и выдерживали в течение 10 мин. Затем добавляли 0,5 мл реактива Фолина и через 30 мин фотометрировали с красным светофильтром. По калибровочной кривой определяли содержание продуктов расщепления белка в опытной .и контрольной пробе (в пересчете на микрограммы тирозина). По разности содержания тирозина в опытных и контрольных пробах с учетом разведения проб, а также количества фермента, взятого в реакцию, определяли накопление продуктов гидролиза белка. Активность выражали в количестве микрограмм тирозина, освобожденного в указанных условиях из миозина под воздействием 1 мг препарата.
Формула для расчета

где а — содержание тирозина в 2 мл безбелкового фильтрата опытной пробы;
б — то же для контроля;
С — навеска фермента, взятая в пробу, мг.

---

• Определение общего количества летучих редуцирующих веществ в мясе
• Изучение распределения в мясе пуринового азота по фракциям
• Метод исследования основного вещества внутримышечной соединительной ткани
• Определение развариваемости коллагена
• Методы исследования фибриллярных компонентов внутримышечной соединительной ткани
• Фракционирование как способ оценки лабильности соединительной ткани мяса
• Количественное определение N-концевых групп в белках фракции миозина
• Определение легкогидролизуемого фосфора АТФ методом ее осаждения солями ртути
• Определение активности актомиозина по Баленовичу и Штраубу
• Определение содержания азота белков, экстрагируемых солевым раствором
• Определение растворимости белков фракции миозина
• Определение перевариваемости in vitro белков мяса ферментами при последовательном воздействии пепсина и панкреатина
• Количественное определение свободных аминокислот мясного экстракта при помощи хроматографии на бумаге
• Определение количества трудноизвлекаемого («связанного») гликогена
• Определение общего количества гликогена по Пфлюгеру в модификации Вильштеттера
• Трилонометрический метод определения содержания в мясе кальция
• Определение содержания в мясе свободной и связанной воды по методу Грау и Гамма
• Сравнительная характеристика объективных методов определения жесткости мяса
• Интенсификация процесса улучшения консистенции при созревании быстроохлажденного говяжьего мяса путем его обработки препаратом протеолитического фермента фицина
• Технология применения протеолитических ферментов для размягчения мяса при производстве натуральных полуфабрикатов
• Фицин, его свойства и методы получения
• Изменения компонентов внутримышечной соединительной ткани
• Изменения мышечных белков
• Изменения нежности и гидратации мяса
• Изменения микроскопической картины строения тканей мяса
• Общие сведения о применении протеолитических ферментов для улучшения качества мяса
• Механизм протеолиза для улучшения консистенции мяса
• Обработка ультразвуком для повышения нежности мяса
• Ускорение расслабления окоченения путем введения минеральных добавок
• Ускоренное созревание мяса при повышенной температуре с применением антибиотиков