Определение легкогидролизуемого фосфора АТФ методом ее осаждения солями ртути

Аденозинтрифосфорную кислоту обычно определяют по легкогидролизуемому фосфору фракции фосфорсодержащих соединений экстракта, полученного после осаждения растворимых белков трихлоруксусной кислотой.
Сущность метода заключается в том, что из трех остатков фосфорной кислоты, входящих в состав молекулы АТФ, два легко отщепляются при гидролизе в 1 н. растворе HCl при 1000 С.
По разности между содержанием фосфора до и после гидролиза судят о содержании легкогидролизуемого фосфора, входящего в состав АТФ.
Старые методы основывались на осаждении АТФ вместе с неорганическим фосфором в виде кальциевых или бариевых солей.
Как показал Керр, при добавлении щелочного раствора хлористого кальция осаждается только 60—75% АТФ, в то время как при осаждении ацетатом ртути достигается почти полное ее осаждение.
Вместе с тем ацетат ртути практически не осаждает неорганический фосфор, содержащийся в трихлоруксусном экстракте испытуемой ткани.
Поэтому мы остановились на определении легкогидролизуемого фосфора АТФ по методу ее осаждения уксуснокислой ртутью, описанному Саковым, с незначительными изменениями, внесенными применительно к изучаемому объекту.
Мышечную ткань по возможности быстро пропускают через охлажденную мясорубку и фарш собирают в чашечку, находящуюся на льду.
Отвешивают 10 г фарша и переносят в центрифужную пробирку емкостью 40—50 мл, прибавляют 20 мл охлажденной на льду 10%-ной трихлоруксусной кислоты и экстрагируют при помешивании в течение 15 мин на холоде.
Выпавшие в осадок белковые вещества отделяют центрифугированием, сливают фильтрат с осадка в другую центрифужную пробирку и прибавляют 3,5 мл 25%-ного раствора уксуснокислой ртути в 2%-ной уксусной кислоте. После получасового стояния на холоде (когда осадок начнет отделяться от жидкости) смесь центрифугируют, жидкость удаляют декантацией и осадок, находящийся в центрифужной пробирке, дважды промывают 96°-ным спиртом (под спиртом осадок может сохраняться до следующего дня).
После удаления спирта осадок растворяют в 2—4 мл 0,5 н. раствора HCl, переносят количественно в мерную колбу на 25 мл (для парного мяса в мерную колбу на 100 мл), нейтрализуют и доводят водой до метки.
В отдельных порциях полученного таким образом исходного для колориметрирования раствора находят прямоопределяемый и легкогидролизуемый фосфор по Фиске и Суббарову (вместо эйконогена можно принять α-нитрозо-β-нафтол). Прямоопределяемый фосфор находят сразу же после приготовления исходного раствора.
Для определения легкогидролизуемого фосфора в мерной колбе на 25 мл к 5 мл исходного раствора прибавляют 5 мл 2 н. раствора HCl и ставят в кипящую водяную баню на 10 мин. По истечении указанного срока жидкость быстро охлаждают, нейтрализуют и определяют фосфор по Фиске и Суббарову. Последний метод общепринят и основан на определении интенсивности окраски молибденовой сини, образующейся при восстановлении фосфорно-молибденовой кислоты эйконогеном. Может возникнуть сомнение в том, что в условиях выполнявшихся нами опытов осаждаемый ртутными солями фосфор, который впоследствии определяется как легкогидролизуемый, действительно принадлежит АТФ.
Поэтому мы произвели анализ ртутного осадка, полученного при действии уксуснокислой ртути на трихлоруксусные экстракты парного мяса и установили, что в среднем 93,48% содержащегося в ртутном осадке легкогидролизуемого фосфора принадлежит АТФ и только около 6,5% может быть отнесено за счет АДФ.
Следовательно, определение легкогидролизуемого фосфора АТФ методом осаждения ртутными солями в основном правильно отражает распад этого соединения при созревании мяса.
Головкин и Першина отмечают, что неточность определения иногда возникает на том этапе, когда проводится инкубация опытных проб при 37° С с целью восстановления фосфорно-молибденовой кислоты эйконогеном. При этом окрашенные пробы, особенно негидролизованные, слегка мутнеют, что и приводит при колориметрировании к неправильным результатам. Они рекомендуют в таких случаях взвешенные частицы отделять центрифугированием. В нашей работе таких случаев не наблюдалось.
Эти же авторы сравнивали метод ртутного осаждения с адсорбцией углем аденозинполифосфатов и пришли к заключению, что первым из указанных методов в основном выделяется АТФ, а АДФ в осадке содержится только в виде примесей. При адсорбции углем определяется сумма АТФ и АДФ.
Таким образом, первая из указанных методик имеет преимущества перед второй и довольно правильно отражает количественное содержание АТФ в мышце. Погрешность при тщательном и правильном выполнении всех операций анализа колеблется в пределах от 1 до 6%. Только при анализе мышечной ткани после длительного хранения она повышается до 10—12%.