Изучение распределения в мясе пуринового азота по фракциям

В настоящее время разработаны и применяются хроматографические методы разделения и анализа нуклеотидов, нуклеозидов и свободных пуринов. Однако для выполнения точных исследований в ряде случаев целесообразно пользоваться более трудоемким методом химического разделения фракций пуринового азота. Основы методики аналитического разделения и количественного определения нуклеотидов, нуклеозидов и свободных пуринов мышечной ткани разработаны Остерном, Керром, Хитчингсом, Керром и Сер айда рьяном.
Сущность метода заключается в том, что из безбелкового экстракта мышечной ткани нуклеотиды осаждают уксуснокислым уранилом и затем гидролизуют до стадии свободных пуринов; из оставшегося после осаждения нуклеотидов раствора свободные пурины осаждают в кислой среде азотнокислым серебром, а нуклеозиды подвергают кислотному гидролизу также до стадии свободных пуринов.
Во всех трех фракциях свободные пурины осаждают в виде меднопуриновобисульфитного комплекса, который затем разлагают сероводородом в солянокислой среде, и пурины переводятся в раствор в форме своих гидрохлоридов. В отдельных порциях этого раствора для каждой фракции определяют общий пуриновый азот, а в другой части раствора аденин и гипоксантин разделяют пикриновокислым раствором пикрата натрия (в кислой среде пикрат аденина практически нерастворим). Оставшийся в растворе гипоксантин переводят азотнокислым серебром в осадок и отделяют от хлоридов обработкой горячей концентрированной азотной кислотой (AgCl при этом остается в осадке).
Серебряный нитрат гипоксантина подвергают минерализации 10 н. H2SO4, после чего оттитровывают по Фольгарду серебро, находившееся в связанной с гипоксантином форме. По разности между общим пуриновым азотом и азотом гипоксантина определяют азот аденина данной фракции (нуклеотидов, нуклеозидов или свободных пуринов).
Ввиду незначительного содержания азот гуанина не принимается в расчет.
Изучали распределение пуринового азота по фракциям в мясе после 2 ч варки при 90° С. Для этого навеску в 45 г, состоящую из пропорционально взятых количеств измельченного вареного мяса и бульона, помещают в фарфоровую ступку, заливают 40 мл 10% -ной трихлоруксусной кислоты и растирают с песком. Сливают экстракт в центрифужный стакан, а к остатку прибавляют еще 40 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты и после повторения экстракции вновь сливают его в центрифужный стакан. Туда же переносят остаток, смывая его из ступки порцией в 40 мл трихлоруксусной кислоты и центрифугируют. Затем экстракт сливают, нейтрализуют по фенолфталеину сначала 40%-ным, а под конец 10%-ным раствором NaOH и доводят 10%-ным раствором нейтрализованной трихлоруксусной кислоты до определенного объема (150 мл). Выпавший во время нейтрализации осадок отфильтровывают или отделяют центрифугированием.
Определение нуклеотидов. 150 мл нейтрализованного трихлоруксусного фильтрата отмеряют порциями по 35 мл каждая в три центрифужные пробирки по 50 мл, одна из которых градуирована на 15 мл. На каждые 20 мл этого фильтрата прибавляют 1 каплю 10%-ного раствора уксусной кислоты, в результате чего pH нейтрализованного трихлоруксусного экстракта смещается от 8,3 до 6,8. Затем добавляют небольшой избыток (около 0,7 мл на каждые 3,5 мл фильтрата) насыщенного при комнатной температуре раствора уксуснокислого уранила (приблизительно 8%-ный раствор). Большой избыток может вредить дальнейшему определению. Перемешивают стеклянными палочками и дают осадку осесть для того, чтобы установить цвет жидкости. Если она приобретает слегка желтый цвет, то это указывает на наличие необходимого избытка уксуснокислого уранила.
Затем центрифугируют смесь, жидкость сливают, а осадок дважды промывают разбавленным подкисленным урановым реагентом. Промывные воды присоединяют к основному количеству жидкости, и этот раствор сохраняют для определения нуклеозидов и свободных пуринов. В том случае, если жидкость не является совершенно прозрачной, она должна быть отфильтрована и осадок присоединен к фракции нуклеотидов.
Для того чтобы перенести из трех пробирок весь осадок нуклеотидов в одну, растворяют один из осадков в 2 мл 10 н. H2SO4, переносят во вторую пробирку и, наконец, в третью, имеющую градуировку на 15 мл. Аналогичным способом промывают каждую пробирку водой, и промывные жидкости из двух пробирок собирают в третью градуированную пробирку. Для промывки берут количество воды, которое обеспечивает конечный объем в последней пробирке, несколько меньший 15 мл. Полученная кислотность приблизительно нормальная, так как от 0,3 до 0,5 мл кислоты расходуется на растворение осадка. Затем нуклеотиды гидролизуют погружением пробирки в кипящую воду на 20 мин, после чего раствор нейтрализуют 10%-ным NaOH и затем слегка подкисляют при помощи 5%-ного раствора уксусной кислоты.
Выпавший при этом урановый осадок отделяют центрифугированием. Переносят жидкость после центрифугирования в другую центрифужную пробирку на 50 мл. Вместо промывания осадок растворяют в 1 мл 1 н. H2SO4, ополаскивают стенки пробирки и переосаждают нейтрализацией, как описано выше. Центрифугируют и прибавляют жидкость после центрифугирования в пробирку, содержащую главную массу гидролизованных нуклеотидов. Эту пробирку, в которой находится раствор пуринов, помешают в кипящую водяную баню и, когда раствор становится горячим, к нему прибавляется 0,8 мл насыщенного раствора бисульфита натрия (или 1 мл 40%-ного раствора) и 1 мл 10%-ного раствора CuSO4. Раствор бисульфита должен быть свежеприготовленным, так как при хранении в нем снижается концентрация NaHSOs. Смесь нагревают в течение 3 мин при размешивании стеклянной палочкой. Красно-коричневый осадок бисульфита. меди и меднопуринового бисульфитного комплекса затем отделяют центрифугированием и дважды .промывают четырехмиллилитровыми порциями горячей воды.
Осадок размешивают с 3 мл 3 н. HCl, и эту смесь нагревают до кипения на водяной бане. Раствор разбавляют приблизительно до 10 мл кипящей водой, немедленно погружают в кипящую водяную баню и через него пропускают ток сероводорода. Через 3 мин, когда разложение меднопуриновых комплексов закончится, горячий раствор фильтруют в мерную колбу на 25 мл через свободный от азота фильтр диаметром 7 см. Пробирку и фильтр промывают горячей 1 н. HCl и после охлаждения до комнатной температуры содержимое мерной колбы разбавляют до 25 мл. В этом растворе раздельно определяют общий пуриновый азот нуклеотидов по микрокьельдалю и азот гипоксантина.
Определение азота гипоксантина. 17 мл раствора упаривают досуха, пропуская горячий воздух через пробирку с жидкостью, погруженную в горячую воду. Когда объем жидкости в ней уменьшится до 5 мл, водяную баню перестают нагревать, и поэтому температура в конце упаривания не превышает 30° С. Затем гидрохлориды пуринов растворяют в 4 мл горячей воды, раствор охлаждают и к нему прибавляют 2 мл раствора пикрата натрия, подкисленного по метилоранжу пикриновой кислотой. При этих условиях реакции среды никрат аденина выпадает в осадок, а гипоксантина — остается в растворе.
Раствор немедленно фильтруют через асбест. Пробирку и осадок промывают первый раз 2 мл, а затем 1 мл полунасыщенного раствора пикрата натрия, подкисленного по метилоранжу пикриновой кислотой (осадок, содержащий аденин далее не исследуют).
Затем к фильтрату прибавляют 3 мл 1 н. HNO3 и этот раствор нагревают на кипящей водяной бане.
Гипоксантин и хлориды осаждают прибавлением по каплям 2 мл 0,2 н. раствора AgNO3 при нагревании, которое продолжается в течение 5—10 мин, проверяя полноту осаждения; затем раствор медленно охлаждают до комнатной температуры.
После охлаждения его фильтруют через асбест. При этом большая часть осадка остается в пробирке, которая смывается декантацией тремя порциями воды по 5 мл.
Серебряный пикрат гипоксантина растворяют в 3 мл горячей концентрированной BNO3. и он превращается в серебряный нитрат гипоксантина, а хлорид серебра при этом остается в осадке. Для их разделения смесь вновь пропускают через асбестовый фильтр и фильтрат помещают в пробирку из тугоплавкого, нейтрального стекла.
Пробирку и фильтр промывают тремя порциями горячей HNO3 по 3 мл.
После прибавления 1 мл 10 н. H2SO4 фильтрат и промывные воды упариваются и органическое вещество озоляется при добавлении I—2 капель HNO3. Прибавляют 3 мл воды и 1 мл насыщенного раствора железоаммиачных квасцов, после чего раствор титруют 0,01 н. раствором тионианата. Из полученной величины вычитают количество тиоцианата, пошедшее на титрование в холостом опыте. 1 мл 0,01 н. раствора тиоцианата эквивалентен 0,56 мг азота гипоксантина.
Ошибка определения составляет ±1,0%. По этому методу определяют содержание гипоксантина во всех трех фракциях пуринов.
Определение нуклеозидов и свободных пуринов. Для этой цели употребляют жидкость, оставшуюся после центрифугирования и отделения нуклеотидов осаждением уксуснокислым уранилом.
Свободные пуриновые основания отделяют от нуклеозидов осаждением азотнокислым серебром в кислом растворе. Кислотность 0,05 н. H2SO4 (pH 1,5—2) достаточна, чтобы предупредить осаждение нуклеозидов нитратом серебра. Для этого измеряют объем фильтрата и промывных вод после осаждения уранилом, затем жидкость подкисляют H2SO4 до достижения 0,05 н. ее концентрации и обрабатывают 0,02 объемами 1M раствора AgNO3 (осаждение свободных пуринов в кислой среде).
Чтобы избежать кислотного гидролиза нуклеозидов и их возможного осаждения, осадок отделяют по возможности быстро (максимум 1 ч) центрифугированием, затем взбалтывают с водой, смывают в 50 мл центрифужные пробирки и опять центрифугируют. Жидкость после центрифугирования вместе с промывными водами употребляют для определения количества нуклеозидов, а осадок сохраняют для определения свободных пуринов.
Для осаждения нуклеозидов (щелочное осаждение серебром) к жидкости, содержащей нуклеозиды, добавляют 1 н. раствор NaOH до тех пор, пока смесь не станет щелочной по фенолроту. При этом образуется осадок (щелочной серебряный осадок), содержащий не только нуклеозиды и некоторое количество окиси серебра, но также и любое количество урана, которое осталось в растворе после удаления нуклеотидов. Осадок отделяют от раствора центрифугированием в центрифужных стаканах на 250 мл, затем переносят в 50-миллиметровую центрифужную пробирку и там дважды промывают водой. После центрифугирования надосадочная жидкость удаляется.
Из серебряных осадков пурины, содержащиеся в фракциях свободных пуринов и нуклеозидов, экстрагируют соляной кислотой. Для этого осадки нагревают на кипящей бане с 15 мл 0,5 н. HCl в течение 30 мин и затем смесь фильтруют в горячем состоянии. Экстракты собирают в конические центрифужные пробирки, градуированные на 35 мл. В случае исследования фракции нуклеозидов яри этом происходит их распад на пурины и риббозу.
После охлаждения фильтрат разбавляют до 35 мл 0,5 н. HCl.
Дальнейший анализ солянокислотных экстрактов фракций свободных пуринов и нуклеозидов производят так. Уран осаждают из экстрактов нейтрализацией по фенолфталеину 20%-ным раствором NaOH, после чего раствор освобождают 5%-ной уксусной кислотой от цвета индикатора. Осадок солей урана отделяют центрифугированием и жидкость переносят без потерь в коническую цетрифужную пробирку на 50 мл.
Вместо промывки осадок растворяют в 3 мл 1 н. раствора H2SO4 и затем переосаждают. Растворы после переосаждения присоединяют к основной части фильтратов.
Соединенные жидкости затем нагревают на кипящей водяной бане, пурины осаждают добавлением 10%-ного раствора CuSO4 и 40%-ного раствора NaHSO3 и содержание общего пуринового азота и азота гипоксантина данной фракции (свободных пуринов или нуклеозидов) определяют при помощи вышеописанного метода.